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2020-10
新冠病毒的解码者，宏基因组学焦点中的NO.1——mNGS
2003年SARS的发现耗时5个多月，
2013年H7N9的发现用了1个多月，
2019年新冠病毒的全基因组测序仅5天，
得益于高通量测序技术（NGS）的快速发展。
那么，mNGS在临床中的实际应用如何呢？
一篇顶刊综述为您揭晓：
摘要：临床宏基因组学（mNGS）是对患者样本中微生物和宿主遗传物质（DNA和RNA）进行综合分析的一种新兴的诊断技术，这种新兴的方法正在改变医生诊断和治疗疾病的方式，其应用范围广泛，其应用范围包括抗菌素耐药性研究、微生物组学、人类宿主基因表达（转录组学）和肿瘤学。
原名：Clinical metagenomics
译名：临床宏基因组学
期刊：Nature Reviews Genetics
IF：33.133
发表时间：2019年3月27日
通信作者单位：美国加州大学旧金山分校实验医学系
综述框架
综述回顾了mNGS在临床和公共卫生环境中的各种应用， 讨论了在临床实验室中采用mNGS所面临的挑战，并提出了克服这些挑战的步骤。同时展望了mNGS在临床领域的未来发展方向。
临床微生物学领域包括诊断微生物学、从临床样本中识别病原体以指导感染患者的管理和治疗策略、公共卫生微生物学以及社区监测和监测传染病暴发等。
微生物的传统诊断技术包括：培养物中微生物的生长和分离，病原体特异性抗体（血清学）或抗原的检测以及微生物核酸（DNA或RNA）的分子鉴定，通常是通过PCR进行的。
尽管大多数分子分析使用特定的引物或探针仅靶向有限的病原体，但宏基因组学方法可表征样品中存在的所有DNA或RNA，从而能够分析患者样品中的整个微生物组以及人类宿主基因组或转录组。宏基因组学方法已经应用了数十年，以表征各种生态位，从海洋环境到有毒土壤到节肢动物疾病载体再到人类微生物组。
mNGS是对患者样品中微生物和宿主遗传物质（DNA和RNA）的全面分析，正在迅速地从研究转移到临床实验室。mNGS正在改变医生诊断和治疗传染病的方式，其应用范围广泛，包括抗菌素耐药性，微生物组，人类宿主基因表达（转录组学）和肿瘤学。mNGS已成为精确诊断传染病的关键驱动力，推动了精确医学工作在该领域的个性化患者护理。
到目前为止，mNGS的临床应用已经包括对各种综合征和样本类型的传染病诊断，疾病和健康状态下的微生物组分析，通过转录组学鉴定人类宿主对感染的反应以及肿瘤相关病毒及其基因组整合位点的鉴定等。
一、传染病诊断：
传统的诊断病人感染性疾病的临床模式是由医生制定鉴别诊断，然后进行一系列测试，试图找出病因。临床样品中病原体常规检测的范围包括鉴定培养中生长的微生物（例如，通过生化表型检测或基质辅助激光解吸/电离（MALDI）飞行时间质谱法），检测生物体特异性生物标记物（例如抗原用乳胶凝集试验或酶联免疫吸附试验（ELISA）抗体试验或用PCR对单个试剂进行核酸试验。这些通常包括与确定的临床综合征有关的最常见病原体，如脑膜炎和脑炎、急性呼吸道感染、败血症或腹泻病。
分子诊断分析为诊断最常见的感染提供了一种相当经济有效和快速的方法（通常< 2 h的周转时间）。然而，目前使用的几乎所有常规微生物试验一次只能检测一种或有限的病原体，或者要求从临床样本中成功培养微生物。
相比之下，虽然目前使用的NGS分析方法在速度上无法与传统的检测方法相比——在Illumina仪器上单独进行的测序需要超过18小时，但mNGS可以使多种病原体——病毒、细菌，真菌和/或寄生虫——根据唯一可识别的DNA和/或RNA序列从培养物或直接从临床样本中识别。原则上，几乎所有的病原体，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫，都可以在一次检测中鉴定出来。NGS方法的另一个关键优点是，测序数据可能被用于除了鉴定致病病原体之外的其他分析，例如通过RNA测序（RNA-seq）对转录组进行分析，从而确定微生物组特征和人类宿主反应的平行分析。
因此，mNGS在诊断中的临床应用可能是在最难诊断的病例中，或者对于潜在病原体谱更广的免疫功能低下的病人。临床样本的非靶向mNGS可能是最有前途的感染综合诊断方法。
二、临床微生物组分析：
许多研究人员现在用mNGS代替16SrRNA基因的靶向测序来深入鉴定微生物组。公众越来越认识到微生物组可能参与急性和慢性疾病的状态。然而，目前还没有一种基于微生物组学的检测方法被临床用于疾病的诊断或治疗，部分原因是人们对微生物组学的复杂性及其在疾病发病机制中的作用认识不足。
微生物组学分析在Clostridiumdifficile相关疾病的治疗和治疗中有着广阔的应用前景。C. difficile能感染肠道，产生毒素，可导致腹泻、脱水、败血症和死亡。C. difficile难治性感染只发生在微生物群的环境中，而微生物群的环境会因暴露于广谱抗生素或最近的胃肠道手术等因素而改变。粪便移植治疗和潜在治疗C. difficile感染的有效率为80%-90%，这突出了微生物群在艰难梭菌感染中的重要性。在多个研究中使用mNGS来表征微生物组分有助于细菌-益生菌混合物的开发，这种混合物可以作为预防或治疗艰难梭菌相关疾病的药丸使用。
微生物组的另一个潜在应用是分析细菌多样性，这可以提供病人的疾病是传染性的还是非传染性的线索。例如，一项用于鉴别肺炎患者呼吸道病原体的mNGS研究发现，经培养证实感染的个体其呼吸道微生物组的多样性显著降低。这种被称为失调的微生物群的改变也被证明与对于肥胖、糖尿病和炎症性肠病，微生物群的操作可能是治疗这些病理状况的一个途径。
三、人类宿主感染反应分析：
mNGS侧重于微生物的reads数，然而，在研究人类宿主对感染的反应时，基因表达分析有一个补充作用。尽管RNAseq分析通常是在全血或外周血单个核细胞（PBMC）样本上进行的，但任何体液或组织类型都可能适用于这些分析。利用RNA-seq表达谱对基因进行分类已被用于描述几种感染，包括葡萄球菌菌血症、莱姆病、念珠菌病、结核病（区分潜在和活动疾病风险）和流感。基于机器学习的RNA-seq数据分析已被用于癌症分类，而这些方法的使用可能对传染性疾病很有希望。
人类宿主的RNA-seq分析可用于直接从临床样本中识别新的或未被充分认识的宿主-微生物相互作用，如之前对莱姆病、登革热或疟疾患者所示。RNA-seq在病原菌仅短暂存在的临床病例中可能特别有用（例如早期莱姆病或虫媒病毒感染，包括西尼罗河病毒）；类似于血清学检测，根据病原体特异性人类宿主反应，间接诊断感染是可能的。对病原体特异性宿主反应的分析也可能有助于在复杂的临床亚基因组样本（如多微生物脓肿或呼吸道流感）中鉴别真正的病原体。
RNA-seq的另一个有前途的应用是在区分急性疾病的传染性和非传染性病因。例如，如果根据宿主反应判断一种疾病更可能是非传染性的（例如，自身免疫性疾病），临床医生可能更愿意停止使用抗生素，并用类固醇和其他免疫抑制药物积极治疗患者。
四、肿瘤学应用：
在肿瘤学中，识别突变基因的全基因组或定向NGS方法可用于同时发现与癌症相关的病毒（即疱疹病毒、乳头状瘤病毒和多瘤病毒）和/或收集病毒与宿主相互作用的数据。
例如，mNGS对发现Merkel细胞多瘤病毒（图1D）至关重要，目前认为Merkel细胞癌是一种罕见的皮肤癌，最常见于老年患者。迄今为止，美国食品和药物管理局（FDA）已批准临床使用两个NGS小组测试肿瘤样本中可操作的基因组畸变。在这些样本中检测与整合病毒和外源病毒相对应的读码，可以在面板上添加特定的病毒探针，也可以在对整个肿瘤基因组或菲氏体进行测序时偶然完成。
对癌症中的综合性或活动性病毒感染及其参与信号传导途径的额外了解，可为靶向抗病毒和/或化疗药物的预防和治疗干预提供信息，这一点可通过治疗后丙型肝炎病毒相关性肝细胞癌的风险降低来证明直接作用的抗病毒药物。在未来，液体活检标本（如血浆）中无细胞DNA的mNGS可用于免疫功能低下患者早期癌症的同时鉴别和感染的诊断。
总结与展望
作为一种综合性的直接检测方法，mNGS可能最终取代临床微生物学中的培养、抗原检测和PCR方法，改变医生诊断和治疗传染病的方式。
研究团队预测在未来5年内，评估mNGS临床效用和成本效益的前瞻性临床试验数据将可用；mNGS的总体成本和周转时间将继续下降；mNGS的其他方面（如纳入人类宿主反应和微生物组学数据）将证明临床上有用；自动化样本处理和微流控设备将被开发用于按钮操作；计算分析平台将更广泛地用于本地和云端，从而消除对专门的生物信息学专业知识的需求。
我们将见证mNGS的广泛民主化，因为基因组分析不仅对医生和研究人员开放，而且还通过众包计划广泛地向患者和公众开放。此外，在一个病原体不断出现的世界里，我们设想基于mNGS的检测将在监测和跟踪新的疾病爆发方面发挥关键作用。随着监测网络和测序等快速诊断平台在全球的部署，将有可能在更早的阶段发现并控制传染病爆发，从而拯救生命和降低成本。在不久的将来，随着我们与传染病的长期斗争，mNGS将不再是一种奢侈品，而是临床医生医疗设备中的必需品。
参考文献
Chiu,C.Y.,Miller,S.A.Clinical metagenomics.Nat Rev Genet 20, 341–355 (2019). https://doi.org/10.1038/s41576-019-0113-7
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